Ласкаво просимо на cytology.com
Клітина

Вивчення фіксованих клітин
Не дивлячись на важливість і залишкову інформативність вітальних спостережень, велика частина відомостей про структуру і властивості клітин отримана на фіксованому матеріалі. Якщо клітину пошкодити, вона починає зазнавати ряд змін, а після загибелі клітини в ній активуються автолітичні ферменти, що приводить до грубих змін клітинної структури. Отже, завдання фіксації – убити клітину, припинити активність внутрішньоклітинних ферментів запобігти розпаду клітинних компонентів, а також уникнути втрати структур і речовин, перешкоджати появі структур, відсутніх в живій клітині (артефактні структури). На жаль, ще не знайдений такий хімічний фіксатор, який задовольняв би всі ці вимоги.
Часто для фіксації клітин використовуються альдегіди і їх суміші з іншими речовинами. Як фіксатори застосовують також спирти, що викликають необоротну денатурацію білків, осадження нуклеїнових кислот і полісахаридів. Облягаючою дією володіють також сулемові фіксатори і фіксатори з покриновою кислотою. Фіксатори, що містять чотириокис осмію, добре зберігають ліпіди.
Після фіксації об'єкти надалі можна піддавати додатковій обробці. Одній з головних таких обробок є фарбування клітин. Саме додаткове фарбування клітин дозволило виявити в них масу деталей.
Скло з фіксованими мазаннями одноклітинних організмів або з клітинами культури тканини можна безпосередньо поміщати у фарбники. Але для фарбування клітин у складі органів необхідно отримати їх зрізи. Вивчають також зрізи і окремих клітин.

 

Вітальне (прижиттєве) вивчення клітин
Світловий мікроскоп дозволяє бачити живі клітини. Для короткочасного спостереження клітини поміщають в  рідке середовище на наочне скло. Якщо необхідне тривале спостереження за клітинами. То використовуються спеціальні камери: це або плоскі флакони з отворами. Закритими тонкими стеклами, або ж розбірні плоскі камери. Як об'єкти можна використовувати вільноживучі одноклітинні прості і інші одноклітинні організми, клітки крові або ж роз'єднані тканинні клітини багатоклітинного організму як тваринного, так і рослинного походження. У будь-якому з цих випадків клітини вивчають в спеціально підібраних середовищах. Вільноживучі одноклітинні організми розглядають і вивчають в тих же середовищах, в яких вони живуть в природних умовах або культивуються в лабораторіях. Так, для деяких простих створені штучні середовища, на яких вони ростуть і розмножуються. Звичайно це збалансовані сольові розчини з добавками мікроорганізмів або інших простих, слугуючих для них їжею.
Клітки крові або інші вільні клітки багатоклітинних можуть вивчатися в краплі плазми або в спеціальних синтетичних середовищах.
Для вивчання клітин органів і тканин тварин  використовують метод клітинних культур. Більш простій варіант цього методу полягає в тому, що а камеру . наповнену живильним середовищем (суміш плазми крові з ембріональним екстрактом або суміш синтетичного середовища з додаванням плазми крові), поміщають невеликий шматочок живої тканини. Через деякий час на периферії такого шматочка починається ділення і зростання кліток. У іншому випадку вирізаний шматочок тканини злегка обробляють розчином ферменту трипсину або хелатона версена, що приводить до його дисоціації, до повного роз'єднування кліток один від одного. Потім таку суспензію відмитих кліток поміщають в судину живильним середовищем, де вони опускаються на дно, прикріпляються до скла і починають розмножуватися, утворюючи спочатку колонії, а потім суцільний клітинний пласт. Так ростуть одношарові клітинні культури, дуже зручні для прижиттєвих спостережень. Краще всього для отримання первинних культур з тканин тварин використовувати ембріональний матеріал; культури з кліток дорослих організмів ростуть дуже погано.
При культивуванні кліток поза організмом окрім зміни середовища важливо підтримувати і необхідну температуру(близько 20 градусів для холоднокровних і близько 37 градусів для теплокровних). Обов'язковою умовою культивування кліток є дотримання стерильності. Існує цілий ряд тривало культивованих кліток; це спеціальні клітинні штами, що пристосувалися десятиліттями до зростання поза організмом. Переважно це клітки пухлинного походження або значно змінені клітки. Властивості пухлинних кліток, що придбали. Метод культивування кліток поза організмом широко використовується не тільки для цитологичеськіх, але і для генетичних і вірусологічних і біохімічних досліджень.
У культурі можна вирощувати рослинні клітки. Для цього шматочки тканини обробляються ферментами. Розчинювальними клітинні оболонки, клітинні тіла, що відокремилися, протопласти, поміщають в культурне середовище, де вони діляться і утворюють зони кліток, що розмножилися.
Спостереження за живими клітинами зазвичай реєструються у вигляді фотографій, зроблених за допомогою спеціальних фотонасадок до мікроскопа. Живі клітини можна знімати і на кіноплівку. У ряді випадків така микрокиносъемкадае1т дуже важливу інформацію. Застосовуючи прискорену або сповільнену кінозйомку (цейтраферная кінозйомка), можна детально бачити протікання таких важливих процесів, як ділення клітин. Фагоцитоз, перебіг цитоплазми, биття вій і т.д.червоним кольором.
Тепер з розвитком комп'ютерних технологій за допомогою спеціальних телекамер можливо отримувати зображення кліток прямо на моніторі комп'ютера, записувати їх в пам'яті комп'ютера, всіляко обробляти отримувати відбитки на кольорових або чорно-білих принтерах. Таку комп'ютерну відеотехніку можна використовувати і для цейтраферной зйомки рухомих об'єктів. При дослідженні живих клітин використовують методи мікрохірургії, оперативної дії на клітки. За допомогою приладу мікроманіпулятора клітки розрізають. Витягують з них частини, вводять речовини(мікроін'єкції) і т.д. мікроманіпулятор поєднується із звичайним мікроскопом, в який спостерігають за ходом операції. Мікрохірургічними інструментами служать скляні гачки. Голки. Капіляри. Які мають мікроскопічні розміри і виготовляються на спеціальних приспособлениях-«микрокузницах». При мікроманіпуляціях клітки поміщають в спеціальні камери, в які вводять також інструменти. Так, за допомогою мікроманіпулятора вдалося пересалити ядра від одного штаму амеби до іншого і довести, що саме клітинне ядро визначає фізіологічні особливості клітки в цілому. За допомогою мікроманіпулятора вдалося ін'єктувати в клітку амеби колоїдне золото, а потім досліджувати розподіл його частинок в цито плазмі і ядрі. За допомогою таких мікрохірургічних інструментів можна повертати в клітках мітотічеськіє веретена, відтягати окремі хромосоми, вводити в живу клітину мічені антитіла або різні білкові молекули. Окрім механічної дії на клітки в мікрохірургії останнім часом широко застосовують мікропучки ультрафіолетового світла або лазерні мікропучки. Це дає можливість практично вмить інактівіровать окремі ділянки живої клітини.
Світлова мікроскопія
Світловий мікроскоп – головний прилад біології, є оптичною системою, що складається з конденсатора, об'єктиву і окуляра, які використовуються для розгляду об'єкту. Пучок світла від джерела освітлення збирається в конденсаторі і прямує на об'єкт (рис.6). Пройшовши через об'єкт, промені світла потрапляють в систему лінз об'єктиву; вони будують первинне зображення, яке збільшується за допомогою лінз окуляра. Головна оптична частина мікроскопа, що визначає його основні можливості – об'єктив. У сучасних мікроскопах об'єктиви змінні, що дозволяє вивчати клітини при різних збільшеннях. Головною характеристикою мікроскопа як оптичної системи є роздільна здатність. Зображення, що даються об'єктивом, можна збільшити у багато разів, застосовуючи сильний окуляр, або, наприклад, шляхом проекції на екран (до 10(5) разів). Обчислено, що роздільна здатність об'єктиву, тобто мінімальна відстань між двома крапками, які видно роздільно буде рівна            d=0, 61     ,

  1. де __ - довжина хвилі світла, використовуваного для освітлення об'єкту; n – коефіцієнт заломлення середовища; а - кут між оптичною віссю об'єктиву і променем, що найбільш відхиляється, потрапляє в об'єктив. Дозвіл мікроскопа залежить від довжини хвилі – чим вона менша, тим меншого розміру деталь ми можемо побачити, і від нумерічеськой апертури об'єктиву (n *sin а) –  чим вона вища, тим вище дозвіл. Зазвичай в світлових мікроскопах використовуються джерела освітлення у видимій області спектру (400-700 нм), тому максимальний дозвіл мікроскопа в цьому випадку може бути не вище 200-350 нм (0,2-0,35 мкм). Якщо використовувати ультрафіолетове світло (260-280 нм), то можна підвищити дозвіл 130-140 нм (0,13-0,14 мкм). Це буде перелом теоретичної роздільності світлового мікроскопа, визначуваного хвильовою природою світла. Таким чином, все, що може дати світловий мікроскоп як допоміжний прилад до нашого ока, - це підвищити роздільну здатність його приблизно в 1000 разів (неозброєне око людини має роздільну здатність близько 0,1 мм, що рівне 100 мкм). Це і є «корисне» збільшення мікроскопа, вище за яке ми тільки збільшуватимемо контури зображення, не відкриваючи в нім нових деталей. Отже, при використанні видимої області світла величина 0,2-0,3 мкм є кінцевою межею дозволу світлового мікроскопа.

вапв 

Сучасний світловий (а) і електронний (б) мікроскопи
1 – конденсатор; 2 – об'єктивний столик; 3 – об'єктив; 4 – окуляр; 5 – освітлювач подачі; 6 –гвинти подачі; 7 – фотокамера; 8 – проекційна електромагнітна лінза


Але все таки за допомогою світлового мікроскопа можна бачити частинки меншої величини, чим 0,2 мкм. Цьому служить метод «темного поля», або, як його називали ранішим, метод «ультрамікроскопії». Суть його в тому, що, подібно до порошинок в промені світла (ефект Тіндаля) в клітці при бічному освітленні світяться найдрібніші частинки (менше 0,2 мкм), відображене світло від яких потрапляє в об'єктив мікроскопа. Метод успішно застосовується при вивчанні живих клітин.
Якщо ж необроблені живі або мертві клітини розглядати в світлі, що проходить, то в них розрізняються тільки крупні деталі, оскільки вони володіють іншим коефіцієнтом заломлення і поглинання світлових променів, чим навколишнє середовище. Велика ж частина клітинних компонентів мало відрізняється за цими властивостями як від середовища (води або клітинних розчинів), так і один від одного і тому мало помітна і неконтрастна. Для їх вивчення доводиться змінювати освітленість (втрачаючи при цьому в чіткості зображення) або застосовувати особливі методи і прилади.
Один з таких прийомів – метод фазовий-контрастної мікроскопії, що широко використовується для спостереження за живими клітинами. Він заснований на тому, що окремі ділянки прозорої загалом клітки хоч мало, але все таки відрізняються один від одного по щільності і по світлопереломлюванню. Проходячи через них, світло змінює свою фазу, проте таку зміну фази світлової хвилі наше око не уловлює. Оскільки він чутливий тільки до зміни інтенсивності світла. Остання залежить від величини амплітуди світлової хвилі. У об'єктив фазовий-контрастного мікроскопа вмонтована спеціальна пластинка, проходячи через яку промінь світла випробовує додаткове зрушення фази коливань. При побудові зображення взаємодіють промені, що знаходяться в одній фазі або в протифазі, але що володіють різною амплітудою; тим самим створюється ясно-темне контрастне зображення об'єкту.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


 

 

 

Hosted by uCoz